轉基因大豆MON87705品系試劑盒(熒光-PCR法)

產品名稱】

通用名稱(cheng)：轉基(ji)因大豆 MON87705 品系核酸檢測試劑盒 (熒光-PCR 法)

Name ：Diagnostic Kit for MON87705 Gene DNA (Real-Time PCR Method)

【包裝規(gui)格】50T/盒

本試劑盒(he)適用(yong)于檢測轉基因植物的 MON87705 基因(yin)，用于(yu)篩(shai)查待(dai)檢測植物中是否含(han)有(you) MON87705 成分。其檢測結果僅供(gong)參(can)考。

【檢驗原理】

本試劑盒用國(guo)家標準的(de) MON87705 特異性引物(wu)和探針，用熒(ying)光 PCR 技術進(jin)行轉基(ji)因成分的檢測。

【試劑組成】

說明：不同批號(hao)的(de)試劑盒(he)組分不可交互使用。

【儲存條(tiao)件及有效期】

-20℃避光保存、運輸、避免反復凍(dong)融(rong)，反復凍(dong)融(rong)次數不超過 5 次。有效期 12 個月。

【適用儀器(qi)】

ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJ Opticon2、LightCycler480、Bio-Rad、eppendorf 等系列熒光定量(liang) PCR 檢測儀。

【標(biao)本采集(ji)】稱取 200g 樣品。【保存和運輸】

上(shang)述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過(guo) 6 個月，標本運送應采用 0℃。

轉基因大豆MON87705品系試劑盒(熒光-PCR法)使用方法】

1. 樣品(pin)處(chu)理（樣本處(chu)理區）

1.1 樣本(ben)前處理

固體樣本：用(yong)粉(fen)碎機或冷凍研(yan)磨儀將樣品(pin)研(yan)磨至細粉(fen)狀。

1.2 DNA 提取

對于固(gu)體標(biao)本，DNA 的提取可以采用 SN/T 2584-2010 中推薦的方法：

1) 每個(ge)樣(yang)品(pin)取 2 個平行管。稱取 200mg 粉(fen)碎的樣品(pin)，加(jia)入 1mL 預(yu)冷(leng)至 4℃的抽提液(ye)，劇烈搖動混(hun)勻后，在冰上靜止 5min，4℃條件下 10000g 離(li)心(xin) 15min，棄上(shang)清液；

2) 加入(ru) 600μL 預熱至 65℃的裂解液，充分重(zhong)懸(xuan)沉淀(dian)，在(zai) 65℃恒(heng)溫保持 40min， 期間顛倒混勻(yun) 5 次；

3) 室(shi)溫條件下10000g 離(li)心10min，取上清(qing)液轉移至新離心(xin)管中(zhong)，加入5μLRNAseA， 37℃恒溫 30min，分別用等體積苯酚(fen)：異(yi)戊醇溶液：異戊醇溶(rong)液各抽(chou)提(ti)一(yi)次(ci)；

4) 室溫條件下，10000g 離(li)心 10min，取上清液至新離心管，加入三分之二(er)體積的異丙醇，十分之一體積的 3mol/L 的乙酸鈉溶液（pH=6.5），-20℃放置(zhi) 2-3h；

5) 在(zai) 4℃條(tiao)件下(xia)，10000g 離心(xin) 15min，棄(qi)上(shang)清液，用(yong) 70%乙醇(chun)洗滌沉(chen)淀(dian)一(yi)次，倒出乙醇(chun)，晾干沉(chen)淀(dian)；

6) 加(jia)入 50μL TE（pH8.0）溶解沉淀，所得溶解即為樣品 DNA 溶液。也可使用等(deng)效的 DNA 提取試劑盒(he)。

油脂樣本請直(zhi)接選(xuan)用市售油脂 DNA 提取試劑盒，按說明操作。

2. 試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測(ce)樣本(ben)總數，設所需要的(de) PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

3. 加樣(yang)（樣(yang)本處理區）

將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL，加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1 將待檢測反(fan)應(ying)管置(zhi)于熒光定(ding)量(liang) PCR 儀反(fan)應槽(cao)內；

1.1 設置好通道、樣(yang)品信息，反應(ying)體系設置為 25μL；熒光通道選擇(ze)： 檢測通道

（Reporter Dye）FAM， 淬滅通(tong)道（Quencher Dye）選擇(ze) NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

1.2 推薦(jian)循(xun)環(huan)參數設置(zhi)：

轉基因大豆MON87705品系試劑盒(熒光-PCR法) 結果(guo)分析判(pan)定(ding)

結(jie)果分析條件設定

設置 Baseline 和(he) Threshold：一般直(zhi)接按機器自動分(fen)析(xi)的結果分(fen)析(xi)，當曲線出現整(zheng)體傾(qing)斜時，根據(ju)分析(xi)后圖像(xiang)調節 Baseline 的 start 值(zhi)(一般可在 3~15 范圍內調節(jie))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至(zhi)高(gao)于陰(yin)性對照)，重新(xin)分(fen)析結果(guo)。

 結果判斷

陽(yang)性：檢測通道 Ct 值≤35，且曲(qu)線有明(ming)顯的(de)指數增長曲(qu)線；

可疑：檢測通(tong)道 35<Ct 值≤38，建議重復檢測(ce)，如(ru)果檢測(ce)通道(dao)仍為 35<Ct 值(zhi)≤ 38，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣(yang)本(ben)檢測結果 Ct 值>38 或無 Ct 值。

3. 質控標(biao)準

陰性(xing)質控品：Ct>38 或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線(xian)有明顯指數(shu)生長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。