一(yi)、自噬誘導劑  

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nei)質網(wang)應激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即(ji)Inositol monophosphatase，肌醇(chun)單磷酸酶）

(3) Earle's平衡鹽溶(rong)液(ye)：制造饑餓

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

(5) Rapamycin：mTOR抑(yi)制(zhi)劑

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

二(er)、自噬抑制劑  

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑

(2) Bafilomycin A1：質子泵抑制(zhi)劑

(3) Hydroxychloroquine（羥(qian)氯(lv)喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶(rong)酶(mei)體腔堿化劑）

除了選用上述工具藥外，一般還需結合(he)遺(yi)傳學技術(shu)對自噬(shi)相關基因進行干(gan)預：包(bao)括反義RNA干(gan)擾技術(shu)（Knockdown）、突變(bian)株篩選、外源(yuan)基因導入等。

三(san)、自噬過程進(jin)行觀察和(he)檢測 

細胞經誘導或抑制后(hou)，需(xu)對(dui)自(zi)噬過程進行(xing)觀察和(he)檢測，常(chang)用的策略和(he)技術有：

1、觀察自噬體的形成(cheng)

由(you)于自噬(shi)體屬于亞(ya)細胞(bao)結(jie)構(gou)，普通(tong)光鏡(jing)下看不(bu)到，因此，直(zhi)接觀(guan)察自噬(shi)體需在透射電(dian)鏡(jing)下。phagophore的(de)特(te)(te)征(zheng)(zheng)為(wei)(wei)：新月(yue)狀(zhuang)或(huo)杯狀(zhuang)，雙層或(huo)多層膜，有包繞胞(bao)漿成(cheng)分的(de)趨勢。自噬(shi)體（**1）的(de)特(te)(te)征(zheng)(zheng)為(wei)(wei)：雙層或(huo)多層膜的(de)液泡狀(zhuang)結(jie)構(gou)，內含胞(bao)漿成(cheng)分，如線粒體、內質網、核(he)糖體等。自噬(shi)溶酶體（**2）的(de)特(te)(te)征(zheng)(zheng)為(wei)(wei)：單層膜，胞(bao)漿成(cheng)分已降解。（autophagic vacuole，**）

2、在熒光顯(xian)微(wei)鏡下(xia)采用(yong)GFP-LC3融(rong)合蛋白來示蹤(zong)自噬形(xing)成

由于(yu)電鏡耗時長，不利(li)于(yu)監測（Monitoring）自噬(shi)形(xing)成，人們利(li)用LC3在(zai)自噬(shi)形(xing)成過(guo)程(cheng)中(zhong)發生聚集的(de)現象(xiang)開發出了此(ci)技術。無自噬(shi)時，GFP-LC3融合蛋白彌散在(zai)胞漿中(zhong)；自噬(shi)形(xing)成時，GFP-LC3融合蛋白轉位(wei)至自噬(shi)體(ti)膜，在(zai)熒(ying)光(guang)顯微鏡下(xia)形(xing)成多個明(ming)亮的(de)綠色(se)熒(ying)光(guang)斑點(dian)，一個斑點(dian)相(xiang)當于(yu)一個自噬(shi)體(ti)，可以通過(guo)計數來評(ping)價自噬(shi)活性的(de)高(gao)低(di)。

3、利(li)用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變(bian)化(hua)以評價自噬形成

自(zi)噬形成時，胞漿型LC3（即(ji)LC3-I）會酶解掉一小(xiao)段(duan)多肽，轉變為(wei)（自(zi)噬體）膜型（即(ji)LC3-II），因此，LC3-II/I比值的(de)大小(xiao)可估計自(zi)噬水平的(de)高低。

（注意：LC3抗體(ti)對LC3-II有更高的(de)親和(he)力(li)，會造成(cheng)假陽性(xing)(xing)。方法2和(he)3需結合使用，同時需考慮溶(rong)酶體(ti)活性(xing)(xing)的(de)影響。）

4、檢測長壽蛋白(bai)的批量降解(jie)：非特異

5、MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸(shi)胺）染(ran)色：包(bao)括自(zi)噬(shi)體，所(suo)有酸(suan)性(xing)液泡都被(bei)染(ran)色，故屬于非特異(yi)性(xing)的。

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其(qi)能染所有的液泡(pao)，故(gu)也屬于非(fei)特異性的。

四、自噬(shi)相關蛋白(bai)的定位 

在研究自(zi)噬(shi)相關蛋白時，需對(dui)其(qi)進(jin)行定位。由于(yu)自(zi)噬(shi)體(ti)與溶酶體(ti)、線(xian)粒體(ti)、內質網、高爾基體(ti)關系(xi)密切，為了區(qu)別(bie)，常用到一些示(shi)蹤蛋白在熒光顯微(wei)鏡(jing)下(xia)來共定位：

Lamp-2：溶酶體膜蛋白(bai)，可用(yong)于監測自噬(shi)體與溶酶體融(rong)合。

LysoTrackerTM 探針(zhen)：有紅或藍色(se)可選，顯示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：載體(ti)，轉(zhuan)染(ran)后表(biao)達一個融合蛋白(bai)（紅色熒光(guang)蛋白(bai)+線粒體(ti)基質定(ding)位信(xin)號），可用來檢測線粒體(ti)被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探(tan)針：特(te)異性顯示活的(de)線(xian)粒體，熒光(guang)在經過固定后還能保(bao)留。

Hsp60：定位與線粒體基質，細(xi)胞(bao)死亡時(shi)不會(hui)被釋(shi)放。

Calreticulin（鈣(gai)網織蛋白(bai)）：內質網腔

（注意(yi)：這些蛋白均為胞(bao)漿蛋白，爬(pa)片或胰酶消化(hua)的細(xi)胞(bao)在(zai)做免疫熒光前需先透(tou)膜（permeablize），可采用0.1%SDS處理。）